在線凈化與固相萃取的比較-簡單/方便

http://www.thermo.com.cn/Resources/201104/29123547853.pdf

在線凈化LC-MS/MS
系統對動物組織中克倫特羅殘留的檢測分析
趙孔祥1 王海鑒2
1. 天津出入境檢驗檢疫局食檢中心；2. 賽默飛世爾科技（ 中國） 有限公司
克倫特羅俗稱瘦肉精，常被用作飼料添加劑以提高家
畜的瘦肉含量，但由于其嚴重的毒副作用，歐盟于1988
年1 月1 日起禁止鹽酸克倫特羅物質當飼料添加劑使用。
1991 年被FDA 禁止。1997 年，中華人民共和國農業部下
文嚴禁β- 腎上腺素類激素在飼料和畜牧生產中使用，鹽酸
克倫特羅列為*位。2009 年7 月為應對日、韓從我國食
品中檢出鹽酸克倫特羅事件，質檢系統確定了了更嚴格的
出口判定標準（0.05μg/kg），食品檢測已經進入超痕量時代。
在此背景下，我們需要更有效的前處理手段以便我們
得到更加濃縮更加純凈的樣品來提高我們的信號降低我
們的噪音。基于色譜原理的創新樣品制備方法——Turbo
Flow 技術為我們提供了新的思路。這種在線自動過程處理
技術結合了擴散、化學和體積排除的原理，在捕獲感興趣
分析物的同時，快速消除基質干擾。本實驗旨在建立一個
前處理簡單，選擇性靈敏度高的克倫特羅的Turbo Flow 實
用在線凈化方法，并確定該方法的檢出限。
1 實驗部分
1.1 樣品制備
取5g 動物組織樣品與10mL 乙腈，10% 乙酸銨（1:3）
混合溶液混勻勻漿10 分鐘，5000r/min 離心十分鐘取
1mL 上清液經過0.22μm 注射過膜，上機。
1.2 Turbo Flow 條件
系統：
Thermo Scientific Aria
TLX-1 controlled by Aria. software
在線凈化柱： Turbo Flow Cyclone MCX 0.5×50mm
進樣體積： 50μL
上樣溶劑： 0.1% 的甲酸水溶劑
上樣流速： 2mL/min
洗脫溶劑： 1%的氨水甲醇溶液
洗脫體積： 50μL
1.3 HPLC 方法條件
色譜柱：Hypersil GOLD aQ 3μm 100 X 2.1mm
流路A ：0.1% 的甲酸水溶液
流路B ：甲醇
時間（min） A% B% 流速mL/min
0 90 10 0.4
1 90 10 0.4
2.33 80 20 0.4
2.83 60 40 0.4
6 10 90 0.4
6.5 10 90 0.4
8 90 10 0.4
1.4 質譜條件
1.4.1 調諧參數
系統 TSQ Ultra AM
離子源極性： 正離子模式
噴霧電壓： 4500V
鞘氣壓（N2）： 50arb
輔助氣壓（N2）： 16arb
毛細管柱溫度： 350°C
碰撞氣體（Ar）： 1.5mTorr
Skimmer offset 10V
Q1/Q3峰分辨度： 0.7u （單位質量）
1.4.2 SRM 反應參數
被分析組分
母離子
（m/z）
子離子
（m/z）
碰撞能量
（V）
管透鏡電壓
（V）
克倫特羅-D9 286 169.1 28 104
克倫特羅277 132.2 29 94
168.1* 28 94
203.6 15 94
* 為定量離子
2 結果與討論
食物樣品本身基質比較復雜，在進行檢測之前往往
需要一個較長的樣品預處理過程。比如賈曉飛等使用酶
解，高氯酸沉淀蛋白，邵兵等應用HLB 和MCX 兩次SPE
對食品中β2- 受體激動劑進行殘留檢測都取得了很好的效
果，這些方法的目的也都是為了獲得更加濃縮和純凈的樣
品。應用Turbo-Flow 在線凈化技術使得這些工作變得更加
圖1 Turbo Flow 在線凈化與HPLC 聯用方法參數
熱點聚焦 Hotspot
簡潔方便，減少了中間步驟和偶然誤差，使得加標回收的
重復性很穩定，0.05μg/kg 濃度下六平行RSD 為5.36% ；
同時由于樣品更加純凈濃縮，干擾較少，此方法在添加量
為0.02μg/kg 濃度下峰型良好（ 如圖2 所示）。根據歐盟
法規計算此方法檢出限（LOD） 為0.002μg/kg，定量限為
0.006μg/kg 已經能輕松應對實際需要。同時如果有實際
需要，可以采用更長的凈化柱（100mm 規格） 或者采用串
聯凈化柱的方法進一步增加樣品濃縮倍數，來提高檢出限。
由于采用了在線凈化系統，進入分析色譜柱的樣品也更
圖2 0.02μg/kg 濃度色譜圖
圖3 20pg/g 添加回收比較圖。左圖為MCX 固相萃取凈化，右圖為在線凈化結果
為純凈，一定程度上降低了噪音和雜峰的產生。如圖3 所示，
采用Turbo Flow 技術一定程度上起到了穩定基線的作用。
運用Transcend 在線凈化系統的操作軟件Aria OS 的
變量設置功能，可以方便設置批處理程序嘗試不同的洗
脫溶液。在比較不同濃度的氨水甲醇溶液后，結果表明
1% 的氨水甲醇溶液作為洗脫溶液的效果*。使用外
標法計算其與不經過凈化柱的結果得到其回收率為
79%~84%。而且此濃度的氨水甲醇溶液以0.2mL/min 的
速度與0.4mL/min 的分析柱溶液混合不會對液相色譜
產生不良影響，在使用此方法千針后，10 個平行的保留
時間RSD 仍然只有0.1%。
分別配置5pg/mL，10pg/mL，20pg/mL，50pg/mL，
100pg/mL，200pg/mL，500pg/mL，1ng/mL，2ng/mL
的克倫特羅標準溶液，其中都混有100pg/mL 內標，內標
法定量得到標準曲線有很好的線性（ 曲線見圖3），相關系
數R2 為0.9995
向5g 動物組織中分別添加100pg、250pg、500pg
克倫特羅標準，內標法定量，計算其回收率結果表明，經
過在線凈化和內標法校正后樣品回收率非常穩定。簡單的
前處理步驟帶來zui少的偶然誤差。
表1 克倫特羅不同添加水平回收率
添加水平平均回收率% RSD%*
20pg/g 94.2 5.58
50pg/g 96.5 5.36
100pg/g 94.4 2.49
* 為六平行水平下RSD 值
3 結論
采用Turbo Flow 在線凈化技術可以非常方便的按要求
得到更加濃縮，干擾更少的樣品，提高了信噪比，降低了
檢出限。
Turbo Flow 圖4 克倫特羅標準曲線在線凈化技術簡化了前處理步驟，減少了
熱點聚焦 Hotspot
偶然誤差獲得了令人滿意的重現性。
使用Aria OS 操作系統，我們可以很方便的設置批處
理變量，嘗試不同種類或者比例的上樣或者洗脫溶劑。
4 參考文獻
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